梅花鹿、水貂、蓝狐及貉—牛异种体细胞核移植技术研究

【摘要】为了探索梅花鹿-牛异种体细胞核移植技术，为梅花鹿胚胎工程研究奠定技术基础，本论文对其供核细胞的培养和冷冻保存、受体卵母细胞的体外成熟、显微操作、重组胚胎外培养等技术环节进行了探索研究，并在水貂、蓝狐和貉等毛皮动物上验证了建立的异种体细胞核移植技术体系。主要内容如下：（1）梅花鹿、水貂、蓝狐和貉耳皮肤成纤维细胞（EarSkinFibriblasts，ESF）经组织块法原代培养，利用酶消化时间差与贴壁时间差法处理3～5次纯化，结果显示细胞生长特点为贴壁生长、呈梭形、具伪足，F5代细胞生长曲线呈“潜伏期-对数生长期-停滞期”的模式。DMSO作为抗冻保护剂时，梅花鹿、水貂、蓝狐和貉ESF解冻复苏后复苏率分别为89.64%、92.44、91.24和91.04，显著高于甘油作为抗冻保护剂。结论：梅花鹿、水貂、蓝狐和貉ESF具有典型的皮肤成纤维细胞生长特点，通过酶消化时间与贴壁时间差的方法对其纯化可行，冷冻保存时可采用10%DMSO作为抗冻保护剂。（2）牛卵丘-卵母细胞复合体（CumulusOocyteComplexes，COCs）经22h体外成熟培养之后，LH+FSH和PMSG+HCG组成熟率分别为79.1%和75.2%，差异不显著，但是两组成熟率均显著高于对照组；牛COCs经（BrilliantCresylBlue,BCB）染色染色90min后卵母细胞着色率为68.1%，显著高于30、60min组，辨识难度为“中”；牛COCs经39μM的BCB染色后，着色率为64.5%，显著高于13μM组的29.3%；BCB+组和BCB-组的成熟率与对照组比较差异均不显著；在体外成熟培养液中添加50ng/mL表皮生长因子（EpidermalGrowthFactor，EGF）后培养牛的COCs，22h后成熟率为77.4%，显著高于0、10、20ng/mL组。结论：在牛卵母细胞体外成熟培养液中添加国产激素10IU/mLPMSG、15IU/mLHCG和50ng/mL的EGF能显著提高其体外成熟率；BCB法筛选优质卵母细胞在本试验体系下不适用。（3）牛COCs经体外成熟20、21、22h后，0.4μg/mL脱羰秋水仙碱（Demecolcine，DEME）诱导显核率分别为61.0%、65.3%和66.7%，差异不显著；经0.4μg/mLDEME处理60、120min后，显核率分别为70.0%和71.9%，显著高于30min组；经0.5μg/mLDEME处理60min之后，显核率为78.9%，显著高于0.3、0.4μg/mL组；DEME辅助法的去核率为100.0%，显著高于挤压法和盲吸法，三种去核方法的去核时间差异不显著；带下注核与全细胞胞质内注核的成功率分别为100%和94.8%，注核时间分别为31.0s和35.1s，与破膜后胞质内注核比较差异均显著；一步操作和两步操作的相同注核方法处理组之间在激活率、卵裂率和囊胚率方面均无显著差异；0、0.25、0.50和1.00μM白藜芦醇对梅花鹿-牛ISCNT胚胎卵裂率没有显著影响，0.50和1.00μM组囊胚发育率分别为38.0%和36.7%，显著高于0、0.25μM组；梅花鹿-牛ISCNT胚胎用体细胞共培养时，水貂ESF组的卵裂率为55.7%，显著高于对照组，牛卵丘细胞组囊胚发育率为59.4%，显著高于对照组和其他两组。结论：梅花鹿-牛ISCNT研究可采用下面的技术程序：牛卵母细胞经IVM20～22h后，用0.5μg/mLDEME处理60min诱导显核，Pizeo辅助破膜胞质内注核的一步显微操作核移植，激活后的重组胚用牛卵丘细胞共培养。（4）采用Pizeo辅助全细胞胞质内注核的方法构建毛皮动物-牛ISCNT胚胎时，水貂、蓝狐和貉ESF作为供核细胞，在注核成功率、卵裂率和囊胚率之间差异不显著；牛卵丘细胞作为共培养细胞时，水貂、蓝狐、貉-牛ISCNT胚胎的囊胚率分别为43.6%、40.1%和42.1%，均显著高于对照组。结论：梅花鹿-牛ISCNT技术程序同样适用于水貂、蓝狐和貉等三种毛皮动物与牛的ISCNT。
【作者】王士勇；
【导师】杨福合；
【作者基本信息】中国农业科学院，特种经济动物饲养，2014，博士
【关键词】异种体细胞核移植；耳皮肤成纤维细胞；重组胚；梅花鹿；水貂；蓝狐；貉；牛；

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